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大鼠ELISA檢測(cè)試劑盒固體樣本處理原則操作流程

發(fā)布時(shí)間:2018-06-25   點(diǎn)擊次數(shù):2400次
   大鼠ELISA檢測(cè)試劑盒固體樣本處理原則操作流程
  
  大鼠ELISA檢測(cè)試劑盒固體樣本處理原則:稱取1g的固體樣本,用9g的緩沖液溶解,蛋白可以直接離心取上清檢測(cè),細(xì)胞內(nèi)的蛋白,要先收集細(xì)胞,再用破碎,離心取上清。
  
  1、組織標(biāo)本:切割標(biāo)本后,稱取1g組織,加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS,用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),仔細(xì)收集上清。分裝一份待檢測(cè),其余冷凍備用,保存中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。對(duì)于植物組織,不好勻漿的話,就在液氮中充分研磨;
  
  2、大鼠ELISA檢測(cè)試劑盒細(xì)胞內(nèi)蛋白樣本
  
  許多待測(cè)蛋白不是蛋白,而是存在于細(xì)胞內(nèi)的蛋白,這個(gè)時(shí)候,要先收集細(xì)胞,洗滌干凈,再破碎細(xì)胞,離心取上清。
  
  大鼠ELISA檢測(cè)試劑盒操作流程如下:
  
 ?。?)待測(cè)樣品孔中每孔加入待測(cè)樣品100μl,每種樣品設(shè)3個(gè)平行孔;設(shè)兩個(gè)陰性對(duì)照孔,每孔加未處理組的細(xì)胞裂解液100μl;另設(shè)一個(gè)空白對(duì)照孔,加入純細(xì)胞裂解液100μl。
  
  (2)酶標(biāo)板置4℃,包被過夜。
  
  (3)洗板:吸干孔內(nèi)反應(yīng)液,用洗滌液過洗一遍(將洗滌液注滿板孔后,即甩去),之后將洗滌液注滿板孔,浸泡1-2分鐘,間歇搖動(dòng)。甩去孔內(nèi)液體后在吸水紙上拍干。重復(fù)洗滌3-4次。
  
 ?。?)陰性對(duì)照孔每孔加入PBS50μl,樣品孔及空白孔每孔加入1:500稀釋的兔抗人AIF抗體工作液50μl。
  
 ?。?)酶標(biāo)板置37℃培養(yǎng)箱的濕盒內(nèi),孵育60min。
  
  (6)洗板,同(4)。
  
 ?。?)每孔加1:5000稀釋的HRP-標(biāo)記的山羊抗兔抗體工作液100μl。
  
 ?。?)酶標(biāo)板置37℃培養(yǎng)箱的濕盒內(nèi),孵育60min。
  
  (9)洗板,同(4)。
  
  (10)每孔加TMB顯色液100μl,輕輕混勻10s,置37℃暗處反應(yīng)15-20min。
  
  (11)每孔加100μl2mol/LH2SO4終止反應(yīng)。
  
  (12)分別測(cè)450nm吸光值W1和630nm吸光值W2,zui終測(cè)得的OD值為兩者之差(W1-W2),以減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。
  
 ?。?3)數(shù)據(jù)處理:在得出標(biāo)本(S)和陰性對(duì)照(N)的OD值后,計(jì)算S/N值。S/N≥2.1為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。
  
  
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